برز هنية خلال مرحلة الدراسة الجامعية عضواً نشطاً في مجلس اتحاد الطلبة، إلى جانب اهتمامه بالأنشطة الرياضية.

شغل إسماعيل هنية عدة وظائف في الجامعة الإسلامية بغزة قبل أن يصبح عميداً لها عام 1992، كما تولى عام 1997 رئاسة مكتب الشيخ أحمد ياسين بعد إفراج "إسرائيل" عنه.

اعتقلت سلطات الاحتلال "الإسرائيلي" هنية للمرة الأولى عام 1987 بُعيد اندلاع الانتفاضة الفلسطينية، ولبث في السجن 18 يوماً، ثم اعتقل للمرة الثانية عام 1988 لمدة ستة أشهر.

دخل هنية السجن مجدداً عام 1989 بتهمة الانتماء إلى حركة حماس، حيث أمضى ثلاث سنوات معتَقلاً، وبعدها نفي إلى منطقة مرج الزهور في جنوبي لبنان، لكنه عاد إلى قطاع غزة بعد قضائه عاماً في المنفى إثر توقيع اتفاق "أوسلو"، وأصبح رئيس الكتلة الإسلامية في الجامعة الإسلامية بغزة.

ترأس هنية قائمة التغيير والإصلاح التي حصدت أغلبية مقاعد المجلس التشريعي الفلسطيني في الانتخابات التشريعية المنظمة مطلع يناير/كانون الثاني 2006، وأصبح رئيساً للحكومة الفلسطينية التي شكلتها حماس في فبراير/شباط 2006.

تعرض لمحاولات اغتيال حيث أصيب في السادس من أيلول 2003 إثر غارة "إسرائيلية" استهدفت بعض قياديي حماس من بينهم الشيخ أحمد ياسين، ومنع من دخول غزة بعد عودته من جولة دولية في تشرين الأول 2006.

كما تعرض موكبه لإطلاق نار في غزة يوم 20 تشرين الأول 2006 ، واستهدفت "إسرائيل" منزله في غزة بالقصف في حروبها على غزة سعياً لاغتياله.

حرص هنية على فتح الباب أمام المصالحة الوطنية مع السلطة الفلسطينية، وأعلن قبوله التنازل عن رئاسة الحكومة المقالة في إطار مصالحة شاملة تكون حكومة وفاق وطني.

كان هنية ثابتا في مواقفه وأكّد دائما  أن "حماس" منذ انطلاقتها واضحة في استراتيجيتها لم تتغير ولم تتبدل تجاه نظرتها لفلسطين كل فلسطين ولثوابت القضية الفلسطينية وكيفية مواجهة المشروع الصهيوني رغم كل التحديات والظروف الصعبة مشدداً على أنّ الجميع مشاريع شهادة.

كما أنّ هنية كان يعتبر أن الجمهورية الإسلامية هي ركنٌ متين تستند إليه المقاومة الفلسطينية ومحور المقاومة في صراعه المركزي مع العدو الصهيوني والهيمنة الأمريكية.

اختاره مجلس شورى حماس رئيساً لمكتبها السياسي يوم 6 مايو/أيار 2017 بعد انتخابات متزامنة أجريت في العاصمة القطرية الدوحة وغزة عبر نظام الربط التلفزيوني.

أدرجت وزارة الخارجية الأميركية  في عام 2018 اسم هنية على "قوائم الإرهاب" بسبب قرار الاعتراف بالقدس عاصمة "لإسرائيل"، وهو القرار الذي أصدره الرئيس الأميركي آنذاك دونالد ترامب.

ووصفت حركة حماس القرار بأنه "مثير للسخرية"، وأضافت "كأننا كفلسطينيين نبحث عن شهادة حسن سلوك عند أميركا".

اغتال الاحتلال الإسرائيلي 3 من أبناء إسماعيل هنية يوم 10 نيسان 2024 كانوا على متن سيارة مع 5 من أبنائهم يوم عيد الفطر المبارك.